小麦の根圏における13C標識フィトシデロフォアの微生物による分解：微生物が関与する無機化作用の解明

　ムギネ酸を用いてムギネ酸分解菌の単離研究を先駆的に行った人物は、東大土壌学研究室での渡辺・和田コンビであった。その材料は、小生(森敏）がオオムギ(エヒメハダカ）を鉄欠乏水耕液で長期栽培した、その激甚な鉄欠乏クロロシスを呈するオオムギの根を提供したもである。その根の表層に共生する微生物の中からムギネ酸のみを窒素源とする4種類の微生物を彼らは単離した。
渡辺君はこの論文の後に若くして早世した。指導教官であった和田秀徳先生も今から数年前に逝去された。
この論文は以下の日本語の「日本土壌肥料学雑誌」に掲載されており、ここで紹介する論文でも、日本語であるにもかかわらずきちんと文献として引用されている。

Watanabe, S., Wada, H., 1989. Mugineic acids-decomposing bacteria isolated from rhizosphere of iron deficient barley. Jpn. J. Soil Sci. Plant Nutr. 69, 413-417

なお、このムギネ酸分解菌の急速凍結電子顕微鏡像は西澤直子氏によって撮像されたが、論文にはなっていない。当時Prof Marschnerには授業で使いたいからというので譲渡した記憶がある。




小麦の根圏における13C標識フィトシデロフォアの微生物による分解：微生物が関与する無機化作用の解明
Microbial decomposition of 13C- labeled phytosiderophores in the
rhizosphere of wheat: Mineralization dynamics and key microbial
groups involved

Eva Oburger, Barbara Gruber, Wolfgang Wanek, Andrea Watzinger,
Christian Stanetty, Yvonne Schindlegger, Stephan Hann, Walter D.C. Schenkeveld,
Stephan M. Kraemer, Markus Puschenreiter

Soil Biology & Biochemistry 98 (2016) 196e207

（要旨）
植物が放出するフィトシデロフォア（PS）は、低分子炭素化合物であるため、微生物による分解を非常に受けやすい。
しかし、土壌中のPSの動態については、これまでほとんど知られていない。
小麦が放出する主要なPSである13C4-2’-deoxymugineic acid (DMA)を自家合成し、DMAの土壌中での無機化を調べた。
小麦から放出される主要なPSである13C4-2’-deoxymugineic acid (DMA)を用いて、DMAの無機化ダイナミクスを調べた。
アルカリ性土壌2カ所と酸性土壌1カ所の小麦根圏およびバルク土壌で、リン脂質脂肪酸（PLFA）への微生物組み込みを含むDMAの無機化ダイナミクスを調べた。
DMA分子の半減期(3-8 h)およびDMA由来のC化合物（8-38days）は、糖、アミノ酸、有機酸などの他のLMW-C化合物で報告されているものと同じオーダーであった。
無機化およびPLFAデータを組み合わせることで、添加したDMAの40〜65%が24時間後に呼吸されるか土壌微生物バイオマスに取り込まれ、取り込まれた全DMA-13Cの大部分はグラム陰性菌に回収されることが示された。
根の成長ダイナミクスとPSが主に根の先端から排出されることを考慮すると、土壌バルクでのDMAの無機化が著しく遅いことは、土壌中に放出されたPSの鉄捕捉効率を高めるために生態学的に重要である。
　　
　
(まえがき)
イネ科植物によるフィトシデロフォア（PS）の放出（戦略IIと呼ぶ）は、特にアルカリ性土壌で生育する場合、高効率の鉄獲得戦略と考えられている。
フィトシデロフォアは、鉄だけでなく他の微量金属とも強いキレートを形成し、不溶性の鉄酸化物や土壌から鉄を効率的に可溶化することが分かっている（Reichardら、2005；Schenkeveldら、2014a）。
そして、有機リガンドが鉄の再沈殿を防いでいるため、戦略II植物はFe(III)-PS複合体全体を取り込むことになる。
低分子有機 C 化合物である PS は、根から土壌に放出されると微生物による分解を受けやすい。von Wiren ら (1993) は、トウモロコシが放出する鉄キレート化合物の回収量が、石灰岩の基盤で植物を栽培した場合、非好気的な条件で栽培した場合に著しく減少することを示した。
von Wiren ら（1993）は、トウモロコシが放出する鉄キレート化合物の回収量が、無菌 条件に比べ、非無菌条件で石灰岩基質で栽培した場合、著しく減少することを示した。
さらに、栄養溶液培養では、培養液に異なる細菌混合物を接種した場合、PS-Feの取り込みが有意に減少した（Barnessら、1992；Crowleyら、1992）。
さらに、von Wiren ら（1995）は、ソルガム（PS 滲出量が少ない）のアポプラ スティック鉄プールの枯渇が非無菌培養で有意に減少することを示したが、無菌培養と非無菌培養の大麦（PS 分泌量が多い）ではアポプラスト鉄枯渇にほとんど差がなく、PS の鉄除去効率に放出速度（量）と微生物活性が強く影響 していることが示された。
また、Watanabe and Wada（1989）は、大麦の根から6株のムギネ酸分解菌を分離したが、培養液中には1株も見いだせなかった。全体として、PS の微生物分解の様々な側面を調べた研究はほんの一握りで、その大部分は溶液培養または人工基質で行われた。
我々の知る限り、室温で12時間培養したオオムギ根圏土壌から、炭酸アンモニウム抽出可能なムギネ酸が72%減少したことを報告した(Shi et al., 1988)のみであり、PSの微生物による有効利用を示唆するものであった。
PSの微生物利用は、土壌のPS濃度と鉄の可溶化に強い影響を与え、後者はPSの添加量に応じて増加することが示されている（Reichardら、2005；Schenkeveldら、2014a）。
これらの結果はすべて、微生物分解が土壌中のPSの機能効率に重要な役割を果たすことを示唆している。
これまで、PSの滲出速度や根圏のPS濃度は、ほとんどがゼロ鉄養液栽培の植物に関する研究（例えば、Roemheld,1991）から得られていた。
しかし、最近の研究では、鉄ゼロの水耕栽培条件では、土壌栽培に比べてPSの滲出速度が著しく過大評価されることが示された。
その結果、自然の土壌生育条件下での根圏濃度は、当初の予想よりもはるかに低くなった（mMレンジではなく、低mM）（Oburger et al.、2014）。別の最近の研究では、Schenkeveldら（2014b）が概念的な「Fe獲得の窓」モデルを提案した。これは、PSによるFe動員の効率に対する土壌プロセスの影響を、範囲と期間の両面から説明するものである。
彼らは、PSによる土壌からのFe動員の増加（例：根からのPS放出速度の増加、土壌からのFe放出速度の増加、土壌-Fe溶解度の増加）または減少（例：PSリガンドおよび金属-PS複合体の吸着の増加、競合金属の複合化の増加、PSリガンドの（生物）分解の増加）のいずれかのプロセスおよびパラメータを多数同定した。
PS-金属錯体の形成と収着挙動（Reichardら、2005；Schenkeveldら、2014a、2014b）およびそれに対する土壌微生物の影響（Takagiら、1988；Schenkeveldら、2014b）を説明するいくつかの研究は存在するが、土壌中のPSの無機化ダイナミクスはまだ詳細に調査されていない。
過去数十年の間に、安定同位体や放射性同位体を用いた実験手順は、土壌中のC化合物の運命を追跡するための強力な手段であることが分かっている。最近、Nambaら（2007）は、フィトシデロフォアである2’-デオキシムギネ酸（DMA）の化学合成法を発表した。この合成法を我々の共同研究者が応用し、数グラムの合成DMAとmg量の13C4-DMAを生産した（DMA合成と分子構造に関する詳細については、Walterら（2007）を参照。分子構造の詳細はWalterら、2014を参照）。13C-DMA を合成することで、DMAの無機化動態を初めてモニターすることができた。
本研究の目的は以下の通りである。酸性土壌の根圏（小麦、Triticum aestivum cv. Tamaro）およびバルク土壌における13C-DMA 由来の 13CO2 放出を調査し、PLFA-SIP（安定同位体比分析）を用いて、プロービング分析により、DMAの無機化に関与する主な微生物群を特定する。
根圏におけるDMAの無機化勾配 また、根面からの距離の増加に伴う小麦の根圏におけるDMAの無機化勾配も調査した。

さらに、得られたデータを用いて、根面からの距離の増加に伴う DMAの土壌マトリックス（液体および固体）間の分配のダイナミクスを明らかにした。さらに、後者は異なる土壌における呼吸器系の利用とバイオマス（PLFA）への取り込みに分けられた。


（結論）
本研究の結果、微生物分解によって土壌中の PS が鉄を獲得する時間帯が大幅に短縮されることが確認された。
土壌中のDMAの無機化は、糖、アミノ酸、有機酸などの他の低分子根分泌化合物と同様に迅速であり、無傷のDMA分子の半減期は3〜8時間であることが判明した。
アミノ酸と同様に、DMA-Cの最大画分はグラム陰性菌に回収された。
根圏土壌と比較してバルク土壌のDMAの無機化が遅いことは、DMAの大部分がゆっくりと成長する根の先端で放出されることを考慮すると、生態学的に特に重要である。
当初は収着と金属錯体形成が PS のスペシエーションを支配しているように見えるが、我々のデータは、土壌溶液を緩衝する脱着プロセスにより、DMA土壌溶液濃度の低下のみをモニタリングするよりも速い速度で微生物分解が起こっていることが示された。


（以下、図の説明）
　　
図1. 酸性土壌Siebenlinden (A) とアルカリ性土壌Lassee (B) とSantomera (C) において、13C-deoxymugeneic acid (DMA) (1.8, 18 or 180 nmol g_1) を添加した場合としなかった場合の、根圏とバルク土壌の総CO2放出量。値は平均値±SEを表す（n . 4）。
　　
図2. 酸性土壌Siebenlinden (A) とアルカリ性土壌Lassee (B) とSantomera (C) の根圏とバルク土壌で、添加した13C-deoxymugeneic acid (DMA) (1.8, 18 or 180 nmol g_1) が呼吸でCO2に放出される割合。数値は平均値 ± SE (n . 4)、n.d.は未定。1つの時点における根圏とバルク土壌の間の有意な差は星印で示した（*, p < 0.05）。a, b, cの文字は、サントメラ土壌に適用した異なる濃度の間の有意差を示す（p < 0.05）。
　　
図3. 酸性土壌Siebenlinden (A) と2つのアルカリ性土壌Santomera (B) とLassee (C,D) に生育する小麦の根圏とバルク土壌におけるリン脂質脂肪酸 (PLFA) の総和。1.8 nmol g_1 13C-deoxymugineic acid (DMA) を添加し、培養時間を24時間 (Lassee soilのみではそれぞれ 0.5 と 168時間としている)